摘要

猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起猪的急性、高度传染性肠道疾病，导致严重的经济损失，尤其是在哺乳仔猪中死亡率高。目前，尚无特异性抗病毒药物可用。在本研究中，我们在Vero E6细胞中评估了雷公藤红素（一种来源于雷公藤的天然三萜类化合物）的抗PEDV潜力。我们发现雷公藤红素以剂量依赖性方式显著抑制PEDV复制，主要作用于病毒生命周期的进入后阶段。网络药理学分析强调细胞凋亡是关键信号通路，机制研究表明雷公藤红素增强了PEDV诱导的活性氧（ROS）积累，从而触发细胞凋亡并抑制病毒RNA合成、蛋白表达和子代病毒产生。重要的是，抑制ROS可消除雷公藤红素的抗病毒活性，证实了ROS依赖性机制。此外，雷公藤红素在体外对猪丁型冠状病毒（PDCoV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）也显示出抑制作用。这些发现表明雷公藤红素是预防和控制PED及其他猪病毒感染的潜在候选药物。

关键词：抗病毒药物；细胞凋亡；雷公藤红素；网络药理学；猪流行性腹泻病毒

1. 引言

猪流行性腹泻（PED）是一种高度传染性的急性肠道疾病，影响所有年龄段的猪，对哺乳仔猪的影响尤为严重。该病由PED病毒（PEDV）引起，以严重腹泻、呕吐和脱水为特征，在严重暴发中哺乳仔猪的死亡率接近100%。PEDV于1971年在英国首次发现，属于冠状病毒科的甲型冠状病毒属。它具有一个线性的单股正链RNA基因组，按以下顺序排列：5'UTR、复制酶多聚蛋白1a/b（ORF1a/b）、刺突蛋白（S）、ORF3、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）、核衣壳蛋白（N）和3'UTR。PED疫苗开发的一个关键挑战是，来自疫苗接种的免疫压力可诱导S基因突变，使病毒能够逃避免疫。最近的研究表明，由于这种基因突变，商业疫苗无法对流行毒株提供足够的保护。这些问题凸显了探索抗病毒药物作为有效和全面疾病控制替代策略的迫切需求。

近年来，源自植物的化合物因其治疗潜力而受到越来越多的关注，特别是在对抗PEDV等病毒感染方面。值得注意的是，许多现代药物都是从生物活性植物化合物中开发出来的。寻找植物来源的抗病毒药物可以追溯到20世纪50年代，当时科学家评估了200多种植物对鸡胚中甲型流感病毒的疗效。最近，包括槲皮素、双苄基异喹啉生物碱、甘草酸、格里菲斯辛 和 levistolide A 在内的化合物已显示出抗PEDV活性。尽管取得了这些进展，但目前尚无商业化的抗PEDV药物，这凸显了进一步探索天然产物作为抗病毒候选药物的必要性。

雷公藤红素，又称南蛇藤素，是从中药植物雷公藤中提取的一种天然五环三萜类化合物。广泛的药理学研究表明，雷公藤红素具有多种治疗活性，包括免疫调节、抗炎、抗肿瘤、抗纤维化和抗病毒作用，以及对心血管、脑血管和神经系统的保护作用。雷公藤红素通过多种机制对多种病毒表现出抗病毒活性。例如，雷公藤红素通过激活Nrf2/HO-1通路减少马α疱疹病毒8型的复制，通过诱导IFN-α表达和激活JAK-STAT信号抑制登革热病毒复制，并抑制甲型流感病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒和人类细小病毒。值得注意的是，雷公藤红素通过与病毒S蛋白结合、抑制3CL Pro活性、减少病毒复制、降低IL-6分泌以及减轻重症COVID-19患者的肺部病变，对β冠状病毒SARS-CoV-2显示出强效抗病毒活性。这些发现表明，雷公藤红素是一种有前景的抗病毒药物，具有应用于包括甲型冠状病毒PEDV在内的多种病毒的潜力。在本研究中，我们探索了其抗PEDV活性并阐明了潜在机制。

在本研究中，我们在Vero E6细胞中探索了雷公藤红素的抗PEDV活性。通过对雷公藤红素与病毒之间的核心蛋白进行网络药理学分析，我们聚焦于细胞凋亡通路，并揭示了雷公藤红素诱导的活性氧（ROS）介导的细胞凋亡是其抗PEDV效应的关键机制。此外，我们在体外证实了雷公藤红素对另外两种重要猪病毒——猪丁型冠状病毒（PDCoV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的抗病毒活性。这些发现表明，雷公藤红素在养猪业中作为治疗PEDV感染的药物具有相当大的前景。

2. 材料与方法

2.1 细胞培养与病毒

非洲绿猴肾上皮细胞（Vero E6；ATCC CRL-1586）、猪肾15细胞（PK-15；ATCC CCL-33）和猴胚胎肾上皮细胞（Marc-145；ATCC CRL-12231）在添加了10%胎牛血清（FBS；EvaCell）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM；GIBCO）中培养。PEDV毒株CV777（GenBank: KT323979.1）在Vero E6细胞中培养和滴定，PDCoV毒株HKU15（GenBank: NC_039208.1）在PK-15细胞中培养和滴定，PRRSV毒株BJ4（GenBank: AF331831.1）在Marc-145细胞中培养和滴定。

 2.2 抗体与试剂

PEDV N蛋白、PDCoV N蛋白和PRRSV N蛋白的小鼠单克隆抗体由本实验室保存。GAPDH小鼠单克隆抗体（货号#AF0006）、α-微管蛋白小鼠单克隆抗体（货号#AF2827）、β-肌动蛋白小鼠单克隆抗体（货号#AF0003）、HRP标记的山羊抗小鼠IgG（货号#A0216）和HRP标记的山羊抗兔IgG（货号#A0208）购自Beyotime Biotechnology。Bcl-2（124）小鼠单克隆抗体（货号#15071）、Caspase-3（D3R6Y）兔单克隆抗体（货号#14220）和cleaved Caspase-3（Asp175）兔单克隆抗体（货号#9664）购自Cell Signaling Technology。山羊抗小鼠Alexa Fluor 488结合抗体（货号#HS231-01）购自TransGen Biotech。山羊抗兔Alexa Fluor 594（货号#A-11012）购自Thermo Fisher Scientific。

2.3 细胞毒性测定

采用MTT法评估雷公藤红素的细胞毒性。简言之，将接种于96孔板的Vero E6、PK-15和Marc-145细胞用递增浓度（0.25至2 μM）的雷公藤红素（TargetMol，货号#T3028）在37°C、5% CO₂条件下处理24小时。然后移除培养基，加入100 μL MTT（3-[4,5-二甲基-2-噻唑基]-2,5-二苯基四唑溴化物，0.5 mg/mL），在37°C下孵育4小时。去除上清液后，每孔加入150 μL DMSO溶解甲臜晶体10分钟。使用酶标仪在490 nm波长处测量光密度（OD）。使用GraphPad Prism 8.0（GraphPad Software，San Diego，CA）计算半数细胞毒性浓度（CC₅₀）。

2.4 间接免疫荧光测定（IFA）

细胞用PBS洗涤，然后用4%多聚甲醛（PFA）固定20分钟。随后，每孔加入0.25%（V/V）Triton X-100，室温（RT）下孵育30分钟以透化细胞膜。用PBS洗涤三次后，细胞在含5%牛血清白蛋白（BSA）的PBS中室温封闭1小时。加入1:500稀释的PEDV N小鼠单克隆抗体，4°C孵育过夜，然后加入1:1000稀释的山羊抗小鼠Alexa Fluor 488结合抗体，室温孵育1小时。细胞核用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色。使用Olympus CKX53荧光显微镜采集图像。

2.5 蛋白质印迹法

细胞在含1 mM苯甲基磺酰氟（PMSF）的RIPA裂解缓冲液中于4°C裂解。上清液在4°C下以10,000g离心20分钟。等量的细胞裂解液上样到十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶上，然后转移到PVDF膜上。膜用5%脱脂奶粉室温封闭1小时。然后加入1:500稀释的PEDV N小鼠单克隆抗体，4°C孵育过夜，再加入1:1000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG，室温孵育1小时。

2.6 逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）

使用总RNA快速提取试剂盒（Fastagen，中国上海）从样品中提取RNA，并使用带有gDNA Eraser的PrimeScript RT试剂盒（Takara Bio）逆转录为互补DNA（cDNA）。使用ChamQ Universal SYBR qPCR Ｍaster Mix（Vazyme Biotech）按照制造商说明书检测cDNA样品中的基因表达。用于RT-qPCR的引物序列列于表1。在CFX96实时PCR检测系统（Bio-Rad）上进行实时定量PCR。每个靶基因的RNA相对表达量以GAPDH为内参进行标准化，然后使用2^-ΔΔCT方法计算。

2.7 TCID₅₀测定

本研究中所有病毒样品的滴度均使用TCID₅₀方法测定。具体而言，将Vero E6细胞接种于96孔板中，在37°C下培养。弃去上清液后，用10倍连续稀释的样品（测试组）或DMEM培养基（空白对照组）感染细胞4天，然后观察细胞病变效应。测试组和空白对照组各设8个重复孔，采用Reed和Muench方法计算TCID₅₀。

2.8 抗病毒活性测定

进行抗病毒活性测定以评估体外PEDV抑制能力。将生长在24孔板中的Vero E6细胞单层用不同浓度的雷公藤红素预处理4小时，然后用PEDV（感染复数[MOI]=0.1）在37°C下感染1小时。移除上清液，加入含有不同浓度雷公藤红素的新鲜培养基。然后在感染后24小时（hpi）收集细胞和上清液，分别通过RT-qPCR、蛋白质印迹、TCID₅₀和IFA测定抗病毒活性。

2.9 持续抗病毒活性测定

将生长在24孔板中的Vero E6细胞单层用不同浓度的雷公藤红素预处理4小时，然后用MOI=0.1的PEDV在37°C下感染1小时。移除上清液，加入含有不同浓度雷公藤红素的新鲜培养基。然后在12、24和36 hpi收集细胞和上清液，分别通过RT-qPCR、蛋白质印迹和TCID₅₀测定抗病毒活性。

2.10 抗PDCoV和PRRSV测定

对于雷公藤红素抗PDCoV活性实验，将生长在24孔板中的PK-15细胞单层用不同浓度的雷公藤红素预处理4小时，然后用MOI=0.1的PDCoV在37°C下感染1小时。移除上清液，加入含有雷公藤红素的新鲜培养基。然后在24 hpi收集细胞和上清液，通过RT-qPCR和蛋白质印迹测定抗病毒活性。

对于雷公藤红素抗PRRSV活性实验，将生长在24孔板中的Marc-145细胞单层用不同浓度的雷公藤红素预处理4小时，然后用MOI=0.1的PRRSV在37°C下感染1小时。移除上清液，加入含有不同浓度雷公藤红素的新鲜培养基。然后在24 hpi收集细胞和上清液，通过RT-qPCR和蛋白质印迹测定抗病毒活性。

2.11 时间添加测定

将10⁵个Vero E6细胞接种于24孔板中，然后用MOI为0.1的PEDV感染1小时（37°C）。在PEDV感染过程中，药物分别进行预处理（preincubation）、共处理（during-time）、后处理（post-time）或全程处理（full-time）。对于预处理组，细胞用0.5 μM雷公藤红素在37°C下孵育4小时，然后用PBS洗涤三次，再用MOI=0.1的PEDV感染1小时（37°C）。对于共处理组，细胞同时与PEDV和0.5 μM雷公藤红素孵育1小时（37°C）。之后，移除病毒-药物混合物，用PBS洗涤细胞三次，然后加入完全培养基。对于后处理组，细胞首先用PEDV感染1小时（37°C）。之后，移除病毒，用PBS洗涤细胞三次，然后加入含有0.5 μM雷公藤红素的完全培养基。对于全程处理组，细胞首先用0.5 μM雷公藤红素孵育4小时。随后弃去溶液，用PBS洗涤细胞三次。然后，细胞同时暴露于PEDV和0.5 μM雷公藤红素，在37°C下孵育1小时。之后，移除病毒，用PBS洗涤细胞三次，再用含有0.5 μM雷公藤红素的完全培养基处理。在24 hpi收集样品，通过终点稀释法测定病毒滴度，通过RT-qPCR测定PEDV N基因mRNA水平。

2.12 杀病毒测定

将PEDV（1 MOI）与1 μM雷公藤红素或等体积DMSO混合，在37°C下孵育1小时。为了消除雷公藤红素对PEDV感染的潜在影响，将混合物稀释100倍后立即加入Vero E6细胞。72小时后收集病毒，使用TCID₅₀法测定滴度。

2.13 网络药理学

从TCMSP数据库（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）、SwissTargetPrediction数据库（http://www.swisstargetprediction.ch/）和CTD数据库（https://ctdbase.org/）获得雷公藤红素的379个靶点。此外，以"virus"为关键词，在筛选"Relevance"评分大于2后，从GeneCards数据库中获得3830个疾病相关靶点。使用维恩图绘制雷公藤红素与病毒交集靶点。

2.14 分子对接方法

MAPK1（PDB ID: 4QTA）、MAPK3（PDB ID: 3FHR）、IL6（PDB ID: 1ALU）、CASP3（PDB ID: 1GFW）、AKT1（PDB ID: 4QTA）、IL1B（PDB ID: 1HIB）、MAPK8（PDB ID: 2XRW）、NFKB1（PDB ID: 1LE5）、TP53（PDB ID: 4MZR）和MAPK14（PDB ID: 2FST）的蛋白晶体结构均从PDB数据库（https://www.rcsb.org/）下载。雷公藤红素的分子结构（PubChem CID: 122724）从PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载。使用PyMOL软件通过移除任何多余的有机构建和水分子来准备蛋白结构进行对接。使用AutoDock为每个靶点生成对接网格。通过比较原始配体的结合模式，设置半柔性对接参数以识别雷公藤红素具有最有利结合自由能的复合物构象。使用PyMOL软件以三维形式可视化对接结果，清晰展示雷公藤红素与其靶蛋白之间的相互作用。

2.15 细胞内ROS水平的测定

使用DCFH-DA ROS检测试剂盒（Solarbio，中国北京）测定ROS。简言之，将接种于12孔板中的Vero E6细胞用PEDV（MOI=0.1）在37°C、5% CO₂条件下感染1小时，弃去上清液后，用或不用雷公藤红素处理24小时。用PBS洗涤Vero E6细胞三次，然后用10 μM DCFH-DA（溶于DMEM）染色45分钟。Rosup（50 mg/mL）用作阳性对照。在FITC通道检测ROS。使用荧光显微镜分析阳性染色细胞。

2.16 统计分析

所有数据使用GraphPad Prism 8.0软件（GraphPad Software，San Diego，CA）进行分析，并以至少三次独立实验的平均值±标准误表示。组间统计学比较采用Student's t检验（比较两个独立或配对组的均值），而双因素方差分析（two-way ANOVA）用于分析两个分类自变量及其交互作用对连续因变量的影响。采用双尾p值。

3. 结果

3.1 雷公藤红素以剂量依赖性方式抑制PEDV感染

雷公藤红素的化学结构如图1A所示。使用MTT法在Vero E6细胞中进行细胞毒性测试，结果显示半数细胞毒性浓度（CC₅₀）为1.583 μM（图1B）。通过蛋白质印迹、RT-qPCR、TCID₅₀和IFA检测雷公藤红素对PEDV的抗病毒效果。如图1C、D所示，雷公藤红素以剂量依赖性方式显著抑制PEDV N蛋白表达和PEDV N mRNA水平，在24 hpi时，0.1-0.5 μM浓度下观察到显著抑制。一致地，雷公藤红素显著降低了通过基于细胞病变效应的终点稀释法测定的PEDV滴度（图1E）。IFA进一步证实了病毒感染细胞比例的剂量依赖性减少（图1F）。这些结果表明，雷公藤红素在Vero E6细胞中有效抑制PEDV复制，同时表现出极低的细胞毒性。

3.2 雷公藤红素对PEDV表现出持续的抗病毒活性

进一步在12、24和36 hpi测定雷公藤红素的抗病毒效果。RT-qPCR分析显示，在所有检测的时间点，雷公藤红素均显著抑制PEDV N基因的mRNA水平（图2A）。同样，TCID₅₀测定显示，雷公藤红素处理后子代PEDV滴度降低（图2B）。蛋白质印迹分析显示，在雷公藤红素存在下，所有三个时间点的PEDV N蛋白表达均持续降低（图2C），光密度分析进一步验证了这种下调（图2D）。综上所述，这些数据表明雷公藤红素在整个感染周期中对PEDV复制和蛋白合成具有持续抑制作用。

3.3 雷公藤红素在不同感染剂量下均能抑制PEDV感染

在MOI为0.01、0.1和1时评估雷公藤红素的抗病毒效果。RT-qPCR分析显示，在所有MOI下，雷公藤红素均显著抑制PEDV N基因的mRNA水平（图3A）。一致地，TCID₅₀测定显示雷公藤红素降低了PEDV子代病毒滴度（图3B），蛋白质印迹分析证实N蛋白表达降低（图3C）。光密度分析进一步支持了下调（图3D）。综上所述，这些结果表明雷公藤红素在一系列病毒接种剂量下均能有效抑制PEDV复制和蛋白合成。

3.4 雷公藤红素靶向PEDV感染的进入后阶段

我们进行了时间添加测定，以探索雷公藤红素影响PEDV生命周期的哪个阶段（图4A）。将Vero E6细胞分为五组，用0.5 μM雷公藤红素处理：对照组（仅感染）、全程组（-4-24 hpi）、预处理组（-4-0 hpi）、进入期间组（0-1 hpi）和进入后组（1-24 hpi）。RT-qPCR分析显示，全程组和进入后组PEDV N基因转录显著降低，而预处理组和进入期间组则没有（图4B）。类似地，TCID₅₀测定显示，与对照组相比，全程组和进入后组的子代病毒滴度显著降低（图4C）。蛋白质印迹分析证实，只有在全程组和进入后组中，PEDV N蛋白表达才显著降低（图4D）。IFA结果进一步证实了这些发现（图4E）。杀病毒测定显示，雷公藤红素处理对PEDV病毒颗粒没有直接灭活作用（图4F）。此外，我们检查了雷公藤红素对病毒释放的影响。雷公藤红素处理后，细胞外和细胞内的病毒滴度均降低（图4G、H）。然而，细胞外与细胞内病毒滴度的比率保持不变（图4I），表明雷公藤红素不影响病毒释放效率。此外，通过检测病毒双链RNA（dsRNA）中间体，我们证实雷公藤红素抑制了PEDV RNA合成（图4J）。综上所述，这些结果表明雷公藤红素主要靶向PEDV感染的进入后阶段，抑制病毒RNA合成和蛋白表达，但不影响病毒进入、直接灭活或病毒释放。

3.5 网络药理学提示细胞凋亡信号传导参与雷公藤红素活性

通过SwissTargetPrediction和SymMap数据库进行靶点预测，鉴定出379个潜在的雷公藤红素靶点。使用Genecards、CTD和TTD数据库，获得3830个病毒相关靶点。交集分析显示238个重叠靶点可能参与雷公藤红素的抗病毒作用（图5A）。对这些共同靶点进行GO和KEGG富集分析，并使用Cytoscape 3.10.3构建了一个包含183个节点的PPI网络。按度值排名前十的核心蛋白包括MAPK1、MAP3、IL6、CASP3、AKT1、IL1B、MAPK8、NFKB1和TP53（图5B）。通过AutoDock对接分析评估雷公藤红素与前十位核心蛋白的结合亲和力，结合能如表2所示。此外，对接模型展示了雷公藤红素与这些蛋白形成氢键（支持信息：图S1）。

GO富集分析表明，雷公藤红素抑制PEDV复制可能与RNA聚合酶II对转录的正向调控、炎症反应、细胞凋亡调控、基因表达、细胞对机械刺激和肿瘤坏死因子的反应、miRNA转录以及NF-κB信号转导等过程相关（图5C）。KEGG富集分析进一步强调细胞凋亡是最显著富集的通路（图5D）。

3.6 雷公藤红素诱导ROS介导的细胞凋亡以抑制PEDV

网络药理学分析确定细胞凋亡信号通路是雷公藤红素的主要靶点，促使我们进一步研究其在抗PEDV活性中的作用。蛋白质印迹分析显示，与模拟感染对照组相比，PEDV感染细胞在24 hpi时pro-caspase-3水平降低，表明caspase-3被切割（图6A、B）。雷公藤红素处理以剂量依赖性方式进一步增强这种切割，产生明显的cleaved-caspase-3片段。值得注意的是，雷公藤红素单独处理以剂量依赖性方式诱导caspase-3激活，与凋亡诱导剂星形孢菌素相当，并且这种效应被泛caspase抑制剂Z-VAD-FMK消除（图6C），证实雷公藤红素本质上可以触发细胞凋亡。此外，无论是否使用雷公藤红素处理，所有PEDV感染组中Bcl-2表达均下降（图6D）。总之，这些数据支持雷公藤红素增强了PEDV诱导的细胞凋亡。

鉴于细胞内ROS过度积累可触发细胞凋亡，我们接下来研究ROS在雷公藤红素作用背景下的作用。与模拟组相比，雷公藤红素剂量依赖性地诱导ROS积累，并进一步放大PEDV诱导的ROS产生，Rosup作为阳性对照（图6E）。为了进一步探讨ROS积累与雷公藤红素抗病毒活性之间的关系，我们将细胞与雷公藤红素和ROS抑制剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）共孵育。RT-qPCR、TCID₅₀和蛋白质印迹分析结果显示，NAC消除了雷公藤红素对病毒RNA合成、病毒滴度和N蛋白表达的抑制作用（图6F-H）。此外，我们检测了PEDV感染细胞在12和24 hpi时的ROS水平和凋亡标志物（支持信息：图S2A）。结果显示，PEDV感染细胞在24 hpi时ROS水平升高。雷公藤红素处理从12 hpi开始增强ROS水平，并持续到24 hpi，之后没有显著增加。此外，在24 hpi时，雷公藤红素处理的PEDV感染细胞表现出比12 hpi时更强的caspase-3激活，表明ROS产生先于caspase-3激活（支持信息：图S2B）。

我们进一步研究了凋亡抑制剂Z-VAD-FMK是否能像NAC一样逆转雷公藤红素的抗病毒活性。我们进行了Z-VAD-FMK与雷公藤红素的共处理实验。MTT测定显示，单独使用Z-VAD-FMK处理或Z-VAD-FMK与雷公藤红素共处理均未引起明显的细胞毒性（支持信息：图S3A）。然而，雷公藤红素与凋亡抑制剂Z-VAD-FMK共孵育并未消除其对PEDV的抗病毒活性，表现为PEDV N蛋白（支持信息：图S3B）和病毒RNA（支持信息：图S3C）水平未发生变化，表明雷公藤红素的抗病毒作用主要通过ROS调节介导，而非直接诱导细胞凋亡。

这些发现表明，雷公藤红素通过诱导ROS积累进而促进细胞凋亡来抑制PEDV复制。

3.7 雷公藤红素对PDCoV和PRRSV显示出抗病毒活性

临床PEDV感染常伴随其他病毒的共感染。为了评估雷公藤红素更广泛的抗病毒潜力，我们测试了其对PDCoV（另一种冠状病毒）和PRRSV（一种重要猪病原体）的活性。由于PDCoV和PRRSV的体外复制通常在PK-15和Marc-145细胞中评估，我们首先评估了雷公藤红素在这些细胞系中的细胞毒性。雷公藤红素在PK-15细胞中的CC₅₀为1.695 μM（图7A），在Marc-145细胞中为2.638 μM（图7D），表明在后者中毒性较低。雷公藤红素在PK-15细胞中以剂量依赖性方式（0.1-0.5 μM）显著抑制PDCoV S mRNA和蛋白表达（图7B、C）。类似地，如图7E、F所示，雷公藤红素在相同浓度范围内对Marc-145细胞中的PRRSV ORF7 mRNA和N蛋白表达表现出剂量依赖性抑制。这些结果表明雷公藤红素对PDCoV和PRRSV均具有抗病毒效果。

细胞凋亡是一种内在的宿主防御机制，通过清除受感染的细胞来抑制病毒复制。然而，PEDV双向调节细胞凋亡以利于自身：它在受感染细胞中抑制细胞凋亡，为子代病毒复制创造有利环境，同时利用细胞凋亡加速子代病毒的释放和播散。同时，PEDV通过AIF途径和DR5受体激活的Caspase-8途径诱导细胞凋亡，抑制AIF和DR5表达显著破坏PEDV诱导的细胞凋亡和病毒复制。相反，PEDV编码多种在抑制细胞凋亡中起关键作用的病毒蛋白。例如，PEDV ORF3蛋白通过抑制受感染细胞的凋亡来促进其在宿主细胞内的增殖。PEDV nsp9与宿主组蛋白H2BE相互作用，抑制PEDV诱导的ER应激介导的细胞凋亡，从而促进病毒复制。因此，PEDV感染与细胞凋亡之间的关系仍然存在争议。我们的发现表明PEDV诱导细胞凋亡，而雷公藤红素显著增强了这种效应。其他PEDV抑制剂也有类似的观察结果。例如，三乙酰白藜芦醇已被证明通过诱导早期凋亡来抑制PEDV，从而清除PEDV感染的细胞。

在细胞凋亡过程中，线粒体和其他细胞器功能障碍会增加ROS产生，进而通过正反馈环放大细胞凋亡。根据以往研究，雷公藤红素可以触发ROS介导的细胞凋亡并增加ROS水平。同时，PEDV毒株在Vero E6细胞中激活PERK/eIF2α通路，导致ROS生成增加。与我们的发现一致，在levistolide A中观察到类似的抗病毒机制，它通过诱导ROS产生和刺激内质网应激来抑制PEDV复制。然而，雷公藤红素与凋亡抑制剂Z-VAD-FMK共孵育并未消除其对PEDV的抗病毒活性，表明雷公藤红素的抗病毒作用主要涉及ROS调节，而非直接诱导细胞凋亡。例如，研究表明，呼吸道合胞病毒感染期间产生的ROS可以激活宿主的抗病毒免疫反应，而抑制ROS产生会削弱这种反应。这表明ROS可能在雷公藤红素的抗病毒机制中发挥更关键的作用，而细胞凋亡仅仅是ROS调节的下游效应。

然而，本研究仍存在一些未解决的问题，需要在未来进行更深入的研究。例如，我们未能确定雷公藤红素的药物靶点。深入探索雷公藤红素抗PEDV的靶点并全面掌握其机制，不仅支持其临床应用，还能阐明PEDV与宿主之间的相互作用。最近蛋白质组学的进展，包括化学蛋白质组学、蛋白质微阵列、基于降解的蛋白质谱分析、蛋白质组范围的无标记方法、网络药理学、基于靶点的药物筛选、多组学分析和假设驱动的靶点确认，已经揭示了雷公藤红素的多方面作用机制。雷公藤红素众多靶点的鉴定强调了其作为多靶点治疗药物的潜力。后续分析，包括对这些靶点的网络相互作用和频率评估，指出PRDX、HMGB1 、HSP90、STAT3 和PKM2可能是雷公藤红素的关键靶点。这些已报道的雷公藤红素靶点是否与其抗PEDV能力相关，或者它们是否在PEDV感染中发挥重要作用，需要在未来进行更深入的研究。另一方面，评估抗病毒药物的体内功效至关重要。然而，我们尚未进行体内实验来评估雷公藤红素抗PEDV的抗病毒效果。雷公藤红素已用于临床研究，目前的报告显示不良反应极小，没有显著的安全问题。总之，未来关于雷公藤红素抗PEDV特性的研究应优先确定药物靶点、阐明具体的抗PEDV机制，并评估其在猪中的抗病毒效果。

此外，我们还评估了雷公藤红素在体外对PRRSV和PDCoV的抗病毒效果，这表明雷公藤红素可能作为针对更广泛猪病毒的抗病毒药物具有前景。然而，由于缺乏实验材料，其他重要的猪病毒，如非洲猪瘟病毒、经典猪瘟病毒和猪流感病毒，尚未得到进一步验证。未来进一步验证雷公藤红素对更多猪病毒的抗病毒效果，将为雷公藤红素作为抗病毒药物的商业化提供更全面的理论基础。

总之，我们的研究证明了雷公藤红素的抗病毒活性，揭示了其对PEDV复制的抑制作用，并首次证实了ROS参与其抗病毒机制。这些发现对PED的预防和控制具有重要意义。我们的研究为确定潜在的药物靶点提供了有价值的见解，这可能有助于开发新的干预措施。

5. 结论

本研究通过全面的体外实验和网络药理学分析证明，雷公藤红素通过促进ROS介导的细胞凋亡来抑制PEDV复制。这些发现突显了雷公藤红素作为有效抗PEDV病毒药物的潜力，为抗PEDV药物的开发提供了新的理论基础，并有助于全面控制PEDV感染。